本发明涉及抗人淀粉样蛋白单克隆抗体的重链和轻链可变区基因及其编码的多肽。本发明还涉及所述基因和多肽在制备诊断阿尔茨海默病试剂和药物的用途。本发明从培养的寡聚体高亲和性单抗A8杂交瘤细胞中克隆了抗体轻链、重链可变区基因。所得基因可以正确编码小鼠抗体可变区。基于上述已经克隆到的A8抗体轻链、重链可变区基因,可采用基因重组的方法构建和表达多种小分子的嵌合抗体、单链抗体以及Fab等基因工程抗体,以期用于阿尔茨海默病的诊断和治疗。
1.一种抗人淀粉样蛋白Aβ_1-42单克隆抗体,其重链可变区基因的序列如SEQxa0IDxa0NO:1所示;其轻链可变区基因的序列如SEQxa0IDxa0NO:3所示。
2.权利要求1所述的单克隆抗体,所述SEQxa0IDxa0NO:1编码的多肽的氨基酸序列如SEQxa0IDxa0NO:2所示;所述SEQxa0IDxa0NO:3编码的多肽的氨基酸序列如SEQxa0IDxa0NO:4。
3.权利要求1或2所述的单克隆抗体在制备分子量为16.5-25KD的Aβ_1-42寡聚体单克隆抗体中的应用。
4.权利要求1或2所述的单克隆抗体在制备诊断阿尔茨海默病试剂中的应用。
5.权利要求1或2所述的单克隆抗体在构建基因工程单克隆抗体表达体系中的应用。
6.权利要求1或2所述的单克隆抗体在制备阿尔茨海默病治疗药物中的应用。抗人淀粉样蛋白序列表.txt<110>北京交通大学<120>抗人淀粉样蛋白单克隆抗体重轻链可变区基因及其应用<160>4<170>PatentInxa0versionxa03.5<210>1<211>1039<212>DNA<213>人(Homoxa0sapiens)<400>1GGGCTCGTAGxa0TGCAGCTTGCxa0ATGCCTGCAGxa0GTCGACGATTxa0TATGCGGCCGxa0CATGGACAGGxa0xa0xa0xa060CTTACTTCTTxa0CATTCCTGCTxa0GCTGATTGTCxa0CCTGCATATGxa0TCTTGTCCCAxa0AGTTACTCTAxa0xa0xa0120AAAGAGTCTGxa0GCCCTGGGATxa0ATTGAAGCCCxa0TCACAGACCCxa0TCAGTCTGACxa0TTGTTCTTTCxa0xa0xa0180TCTGGGTTTTxa0CACTGAGCACxa0TTCTGGTATGxa0GGTGTAGGCTxa0GGATTCGTCAxa0GCCTTCAGGGxa0xa0xa0240AAGGGTCTGGxa0AGTGGCTGGCxa0ACACATTTGGxa0TGGGATGATGxa0ATAAGTACTAxa0TAACCCATCCxa0xa0xa0300CTGAAGAGCCxa0GGCTCACAATxa0CTCCAAGGATxa0ACCTCCAGAAxa0ACCAGGTATTxa0CCTCAAGATCxa0xa0xa0360ACCAGTGTGGxa0ACACTGCAGAxa0TACTGCCACTxa0TACTACTGTGxa0CTCGAAGGGGxa0GATCTACTATxa0xa0xa0420GATTACGACAxa0ACTTTAACTAxa0CTGGGGCCAAxa0GGCACCACTCxa0TCACAGTCTCxa0CTCAGCCAAAxa0xa0xa0480ACAACACCCCxa0CATCGGTCTAxa0TCGGATCCCTxa0CAATCTCTAGxa0AGGATCCCCGxa0GGTACCGAGCxa0xa0xa0540TCGAATTCGTxa0AATCATGGTCxa0ATAGCTGTTTxa0CCTGTGTGAAxa0ATTGTTATCCxa0GCTCACAATTxa0xa0xa0600CCACACAACAxa0TACGAGCCGGxa0AAGCATAAAGxa0TGTAAAGCCTxa0GGGGTGCCTAxa0ATGAGTGAGCxa0xa0xa0660TAACTCACATxa0TAATTGCGTTxa0GCGCTCACTGxa0CCCGCTTTCCxa0AGTCGGGAAAxa0CCTGTCGTGCxa0xa0xa0720CAGCTGCATTxa0AATGAATCGGxa0CCAACGCGCGxa0GGGAGAGGCGxa0GTTTGCGTATxa0TGGGCGCTCTxa0xa0xa0780TCCGCTTCCTxa0CGCTCACTGAxa0CTCGCTGCGCxa0TCGGTCGTTCxa0GGCTGCGGCGxa0AGCGGTATCAxa0xa0xa0840GCTCACTCAAxa0AGGCGGTAATxa0ACGGTTATCCxa0ACAGAATCAGxa0GGGATAACGCxa0AGGAAAGAACxa0xa0xa0900ATGTGAGCAAxa0AAGGCCAGCAxa0AAAGGCCAGGxa0AACCGTAAAAxa0AGGCCGCGTTxa0GCTGGCGTTTxa0xa0xa0960TTCCATAGGCxa0TCCGCCCCCCxa0TGACGAGCATxa0CACAAAAATCxa0GACGCTCAAGxa0TCAGAGGTGGxa0xa01020CGAAACCCGAxa0CAGGACTATxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa01039<210>2<211>346<212>PRT<213>人(Homoxa0sapiens)<400>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rris水迷宫结果提示,腹腔注射A8可以改善SAMP8的学习记忆能力。本发明人使用5’RACE的方法克隆到Aβ寡聚体高亲和性单抗A8轻链、重链可变区基因。根据抗体恒定区CH-1区的最保守的一段序列设计引物,进行反转录,在cDNA产物的5’端加上Poly(C)尾巴,然后使用针对多聚脱氧核苷酸尾巴设计的锚定引物与基因特异性引物通过PCR方法将目的基因扩增出来。序列分析表明,A8抗体轻链和重链可变区序列与已经提交的小鼠IgG可变区序列同源性达90%与92%。可以确定所得到的序列为抗体轻链和重链可变区序列,而非其它基因的序列。所得VH和VL基因可编码正确的小鼠抗体可变区。A8重链和轻链可变区基因是从能够分泌较高活性的鼠源性寡聚体高亲和性抗Aβ单抗的杂交瘤细胞株中克隆的。其中所述的重链可变区基因全长为450bp,所述的轻链可变区基因全长为429bp,两个基因重组后可用于表达特异性识别和结合Aβ寡聚体的抗体活性片段。所述抗人Aβ_1-42单克隆抗体A8的重链与轻链可变区如SEQxa0IDxa0NO:1~SEQxa0IDxa0NO:4所示。其中:SEQxa0IDxa0NO:1是抗人Aβ_1-42单克隆抗体重链可变区DNA序列;SEQxa0IDxa0NO:2是抗人Aβ_1-42单克隆抗体重链可变区氨基酸序列。SEQxa0IDxa0NO:3是抗人Aβ_1-42单克隆抗体轻链可变区DNA序列;SEQxa0IDxa0NO:4是抗人Aβ_1-42单克隆抗体轻链可变区氨基酸序抗Aβ寡聚体单抗A8轻、重链可变区基因的克隆。分泌产生上述抗阿尔茨海默病单克隆抗体的细胞株为北京交通大学生命科学与生物工程研究院采用传统的骨髓瘤与脾细胞融合的方法获得的一株Aβ寡聚体高亲和性的鼠源性抗人Aβ单抗杂交瘤细胞株,命名为A8,其抗原为Aβ1-42聚集物,其分泌的抗体分子亚型为IgG3。所述A8杂交瘤细胞已经在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏。本发明在制备抗人Aβ单克隆抗体及其性质和功能鉴定中进行了如下实验:1、抗原制备及抗体性质的鉴定Aβ寡聚混合物(即本发明所用的免疫抗原)的制备(见实施例1,“1.Aβ寡聚混合物的制备”)。其亚类为IgG₃,抗原识别表位在Aβ多肽N端1-6位氨基酸。可溶性Aβ_1-42寡聚体是最主要的AD早期致病因子,对神经元的毒性最强。目前,关于诊断和治疗用途的针对16.5-25KDAβ_1-42寡聚体单抗,目前尚未见报道。2、间接ELISA实验结果表明:A8可以很好识别以碱性包被液包被于96孔板的Aβ寡聚混合物。最低检测限为:0.625μg/ml(见实施例2)。用于ELISA的最佳稀释度为1∶10⁶。3、免疫印迹(Westernxa0blot)实验结果表明:A8可以很好识别以SDS-PAGE分离,转移在硝酸纤维素膜的Aβ寡聚混合物,主要识别16.5-25KD的寡聚物(见实施例3)。用于蛋白质免疫印迹的最佳稀释度为1∶4,000。4.免疫组化实验单抗A8可以特异性识别快速老化痴呆模型小鼠(Senescencexa0Acceleratedxa0Mousexa0P8,SAMP8)脑组织的Aβ寡聚体。结果显示:染色清晰,定位准确,基本没有背景干扰。在进行免疫组化过程中,无须抗原修复(见实施例4)。5.Morris水迷宫检测结果显示:A8可以改善SAMP8的学习记忆能力(见实施例5)。6、单抗A8可变区基因的克隆利用5’RACE的方法扩增抗Aβ寡聚体单抗A8轻、重链可变区基因(见实施例6)。用本发明获得的抗人Aβ单克隆抗体,利用双抗体夹心ELISA法(酶联免疫吸附试验)、Westernxa0blot实验、免疫组化等实验方法,可以分别制备三种不同方法的检测阿尔茨海默病的试剂。基于上述已克隆到的抗人Aβ寡聚体单抗A8轻、重链可变区基因,可以采用基因工程方法,构建和/或表达多种小分子基因工程抗体的载体、细胞株和抗体,如单链抗体、嵌合抗体、Fab抗体等,以便用于AD诊断、预防和治疗的基础与临床研究和应用。因此,所述抗人Aβ单克隆抗体还可以制备成为药物,用于诊断、预防和治疗阿尔茨海默病。所述的基因核酸序列克隆至相应的表达载体,转染/转化相应的受体细胞(包括细菌、哺乳动物细胞以及酵母等),得到高表达所述抗体分子的细胞株。此外,本发明的抗人Aβ寡聚体单抗A8轻、重链可变区基因还有如下用途:构建基因工程单克隆抗体表达体系:将所述的抗人Aβ寡聚体单抗A8轻、重链可变区基因的核苷酸序列克隆至相应的表达载体,转染/转化相应的受体细胞(包括细菌、哺乳动物细胞以及酵母等),可以得到高表达所述抗体分子的细胞株。表达后所获得的蛋白产物晶体用于新药开发研究:将所述的抗人Aβ寡聚体单抗A8轻、重链可变区基因在不同表达体系进行表达,所获得的蛋白或多肽产物纯化后,可制成晶体。该晶体在新药的研究开发中,可作为药物靶点,用于新药的结构设计。注:本申请文件中所述的抗人Aβ寡聚体单抗A8轻、重链可变区基因,均表示SEQxa0IDNO:1和/或SEQxa0IDxa0NO:2;所述由这两个基因编码的多肽,均表示SEQxa0IDxa0NO:3和/或SEQIDxa0NO:4序列的多肽。本发明的优点:首先,本发明用于免疫的抗原为Aβ_1-42寡聚体混合物,免疫效果好,小鼠免疫血清效价高。这一点优于常用的“多肽偶联载体蛋白方法”。其次,提供的抗阿尔茨海默病单克隆抗体A8特异性识别16.5-22KD的Aβ寡聚体,具有AD早期诊断的应用前景。由于A8特异性识别可溶性Aβ寡聚体,在免疫治疗实验中,有可能避免与纤维结合,从而降低脑出血等副反应。附图说明:图1为抗Aβ寡聚体单抗A8纯化后的重、轻链。图中1为蛋白质分子量标记(Marker),2为单抗A8的重链和轻链。图2为单抗A8的检测灵敏度。图3为单抗A8和商品化单抗6E10对Aβ寡聚体识别的差异。1:蛋白质分子量Marker;2:检测抗体为A8;3:检测抗体为6E10。图4为单抗A8特异性识别快速老化痴呆模型小鼠大脑皮层及海马区Aβ的情况。图5为Morris水迷宫检测结果,图中,横坐标为治疗后的时间(第1,2,3,4,5天),纵坐标为各组找到平台小鼠的数目(单位:只)。图6为RT-PCR扩增的抗Aβ寡聚体单抗A8轻、重链可变区基因的琼脂糖凝胶电泳图,图中M为DL-2000DNA分子量Marker,1为A8重链可变区基因,2为A8轻链可变区基因。生物材料保藏信息:培养物名称:杂交瘤细胞株A8保藏编号:CCTCC-C200926保藏单位:中国典型培养物保藏中心保藏时间:2009年4月15日具体实施方式:实施例1寡聚体高亲和性抗人Aβ单克隆抗体A8的制备1.Aβ寡聚混合物的制备Aβ_1-42肽由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。参照文献(Lambertxa0M,1998)方法,并且进行必要的调整,将其在近似天然的条件下体外组装得到Aβ_1-42寡聚混合物。先将Aβ_1-42肽1mg溶于冰预冷的六氟异丙醇(1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propannol,HFIP)(Sigma),使Aβ_1-42肽单体化,室温,1h后使HFIP挥发殆尽。然后用无水二甲基亚砜(DMSO)(Sigma)20μl溶解Aβ1-42单体,最后将其置于F12培养基(Sigma)或磷酸盐缓冲体系(体积相应补足1ml)、置4°C,24h,使其自然聚合,用Westernxa0blot检测Aβ_1-42寡聚混合物的制备情况。2.小鼠的免疫接种取6-8周龄雌性BALB/c小鼠5只。分别用Aβ寡聚混合物共进行4次免疫:首次按50μg/只剂量将Aβ寡聚混合物与等体积福氏完全佐剂(Sigma)混匀后,腹腔注射。间隔2周后重复注射,使用福氏不完全佐剂(Sigma),偶联多肽剂量为30μg/只。间隔2周后重复一次;再间隔两周,用纯抗原50μg进行脾内加强免疫,3-4d后取脾融合。3.饲养细胞的制备取6-8周龄BALB/c小鼠,引颈处死,无菌条件下RPMIxa01640培养液(Sigma)冲洗腹腔数次,将冲洗液2000rpm,离心10min。弃上清,用含20%小牛血清的RPMIxa01640培养液悬浮沉淀,细胞计数,调整细胞浓度为10⁵个/ml,加入96孔板中,100μl/孔,置于37°C,5%CO₂培养箱中孵育。4.细胞融合取强化免疫3-4d的小鼠,眼球放血后,收集血清,拉颈处死,无菌取出脾脏,制成单细胞悬液后,按10∶1的比例将脾细胞与处于对数生长期的Sp2/0细胞(经8-氮鸟嘌呤,即8-Azaguanine,简称8-AG筛选)混合,1000rpm离心10min,弃上清,轻弹管底使沉淀细胞呈糊状,37°C水浴中加入0.7mlxa050%PEGxa04000(polyethylenexa0glycol,Sigma),边加边旋转离心管,使细胞保持混匀状态,1min加完,37°C水浴中静置90s,立即缓慢加入20mlxa0RPMIxa01640液,800rpm离心8min,弃上清,加入含20%小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、2%HAT(Sigma)、1%青链霉素(Sigma)的1640培养液,轻轻混匀,调整细胞浓度为2×10⁶个/ml,加入已备有饲养细胞的96孔板中,100μl/孔,置于37°C,5%CO₂培养箱中孵育,逐日观察细胞生长情况,1周后补加含20%小牛血清、1%HT(Sigma)、1%青链霉素的RPMIxa01640培养液,按下列公式计算克隆生长率。克隆生长率(%)=(细胞克隆生长孔/接种孔)×100%5.阳性克隆的筛选及亚克隆待细胞克隆长至视野的1/3时(显微镜放大倍数4×10),小心吸取细胞上清液,10μg·ml^-1Aβ寡聚混合物为包被抗原,ELISA方法检测上清中的抗体,具体方法及判断标准见“4.细胞融合”,按下列公式计算克隆阳性率。克隆阳性率(%)=(抗体阳性孔/检测的细胞克隆生长孔)×100%采用有限稀释法对抗体分泌阳性的孔进行反复克隆化,至所有单克隆孔上清抗体阳性率为100%。6.杂交瘤细胞株的建立将克隆化的阳性克隆移入24孔板、6孔板和T25细胞培养瓶,扩大培养60-90d并建株。7.单克隆抗体的亚类鉴定按照Sigma公司的小鼠IgG亚类鉴定试剂盒(Sigma)操作杂交瘤细胞株分泌单抗A8的IgG亚类为IgG₃。8.单克隆抗体的表位分析使用竞争ELISA法测定单克隆抗体的抗原识别表位:将单克隆抗体与浓度梯度的各个肽段(Aβ1-6,Aβ1-11,Aβ12-28)孵育1h后加入到包被有Aβ寡聚体的酶标板上进行间接ELISA检测。结果表明其表位为N端多肽Aβ1-6。9.单抗的大量制备及纯化接种杂交瘤细胞至降植烷(Sigma)预处理的BABL/c小鼠腹腔,1×10⁷个杂交瘤细胞/只,7-10天后抽取腹水,使用AKTAxa0explore100蛋白层析系统通过Proteinxa0A亲和层析柱纯化单克隆抗体,见图1。用BCA试剂盒(美国PIERCE公司)测定抗体浓度,为3mg/ml。实施例2间接ELISA实验1.方法(1)包被:10μg·ml^-1Aβ寡聚混合物为包被抗原,加入酶标板(SUNRISE公司)中,每孔100μl,4°C过夜。(2)PBS-T(NaClxa08g,KClxa00.2g,Na₂HPO₄.1.44g,KH₂PO₄.0.44g,Tween-20xa00.05ml,补ddH₂O至1L,pH7.2~7.4)洗板:3次,每次5min。(3)封闭:加含0.2%BSA的PBS-T,每孔100μl。37°C,2h。(4)将倍比稀释的单抗A8,加入96孔板中,每孔100μl。37°C,2h。同时设空白对照、阴性对照和阳性对照(分别用小鼠抗人Aβ血清、Calbiochem公司的抗人Aβ1-17)。(5)PBS-T洗板:3次,每次5min。(6)加1∶10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司),每孔100μl。37°C,1h。(7)PBS-T洗板:3次,每次5min。(8)加底物TMB,每孔100μl,20min后,450nm波长检测A值。阳性判断标准如下:(样品孔A值-空白对照A值)/(阴性对照孔A值-空白对照A值)≥2检测的最大稀释度为该抗体的效价。2.结果与结论应用我们制备的单抗A8能够识别包被的Aβ寡聚混合物。最低检测限为:0.625μg/ml。见图2。上述结果说明:单抗A8能够有效识别体外组装的Aβ寡聚混合物,其反应灵敏度较好。实施例3免疫印迹(Westernxa0blot)实验1.方法取50~100μg样品,5×样品缓冲液,混匀后上样,先以100V电压使蛋白通过浓缩胶。当样品进入分离胶时,调节电压使其恒定在120V。当溴酚蓝泳动至凝胶底部时,结束电泳,取下凝胶,常规用考马斯亮蓝R-250染色法染色;将凝胶和硝酸纤维素膜分别放入装有印迹缓冲液的容器里平衡10min,依次在放入滤纸、凝胶、NC膜、滤纸,成“三明治”状,倒入转膜缓冲液,胶面朝负极,NC膜面朝向正极,小心避免并赶去气泡。接通电源,使恒流80mA连续转移2h,切断电源。转膜结束后,用丽春红S染色液(10×丽春红S贮存液配制方法为:称取丽春红Sxa02g,三氯乙酸30g,璜基水杨酸30g,加水至100ml;用时按照1∶10的比例用用去离子水稀释)确定蛋白条带位置,做相应的标记。用封闭液封闭硝酸纤维素膜(称取脱脂奶粉5g,溶于0.1mol/Lxa0PBST(NaClxa08g,KClxa00.2g,Na₂HPO₄.1.44g,KH₂PO₄.0.44g,Tween-20xa00.05ml,补ddH₂O至1L,pH7.2~7.4)100ml),4°C封闭过夜。用封闭液液稀释单抗A8,浓度一般为0.2~1μg/ml,于4°C孵育12~14h,或于20~37°C孵育2h。用0.1mol/Lxa0PBST洗涤硝酸纤维素膜4次,每次5~10min。用PBS稀释HRP标记的二抗,稀释度为1∶1000,室温孵育1h。用0.1mol/Lxa0PBST洗涤硝酸纤维素膜4次,每次5min。按照PIERCE化学发光试剂盒说明,将A液和B液等体积混合,加在硝酸纤维素膜上,2~5min后,用X光片曝光显影,观察结果。用Quantityxa0Onexa0software(BIO-RAD)软件进行条带半定量。2.结果与结论Westernxa0Blot结果,纯化的A8主要识别低分子量寡聚体(以识别寡聚混合物中16.5KD左右成分),此外与单体、高分子量寡聚体和原纤维又交叉反应。6E10对单体、低分子量寡聚体、高分子量寡聚体和原纤维的识别没有差异。见图3。上述结果说明,单抗A8对Aβ寡聚混合物中16.5KD左右成分反应最强,与6E10对寡聚混合物的识别效果明显不同。单抗A8可以利用Westernxa0Blot进行样本的Aβ检测。实施例4免疫组化实验1.方法(1)脱蜡、水化。(2)PBS洗两次各5分钟(3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H₂O₂,室温封闭5~10分钟,蒸馏水洗3次。(4)抗原修复。(5)PBS洗5分钟。(6)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。(7)滴加单抗A8,室温1小时或者4°C过夜或者37°C1小时(4°C过夜后在37°C复温45分钟)。(8)PBS洗三次每次2分钟。(9)滴加生物素化二抗(山羊抗小鼠IgG),20°C~37°C20分钟。(10)PBS洗3次每次2分钟。(11)滴加试剂SABC,20°C~37°C20分钟。(12)PBS洗4次每次5分钟。(13)DAB显色:DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色(镜下掌握显色程度)。(14)蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。(15)脱水、透明、封片、镜检。2.结果与结论结果显示,皮质与海马区染色清晰,定位准确,背景较低。见图4。单抗A8可以作为脑皮质与海马区Aβ检测的抗体。实施例5Morris水迷宫检测1、实验目的:检测单抗A8对快速老化痴呆模型小鼠的治疗作用2、实验动物实验动物SAMP8购自北京维通利华实验动物技术有限公司,委托北京大学医学部医学实验动物中心饲养。分组情况如下:按照注射药物不同分为抗体A8治疗组、小鼠非特异性IgG注射组、生理盐水注射组、SAMP8空白对照组,每组12只。3、实验方法参照文献(Leexa0EB,2006)的方法,以单抗A8腹腔注射8月龄雄性SAMP8小鼠(400μg/只),每周1次,治疗8周以后,进行Morris水迷宫检测(在北京大学医学部医学实验动物中心完成)。Morris水迷宫检测步骤:(1)设计特制的水迷宫主要由一圆柱型水池和一可移动位置的平台组成。水池高70cm,直径80cm,平台直径8cm,水池上空通过一个数字摄相机与计算机相连接。(2)预先在水池中注入清水,水深15cm,池壁及池底均为黑色,使池水变为不透明的黑色,平台表面为黑色,使小鼠不能看到,水面高出平台表面0.5cm。(3)水温控制在22±0.5°C,在水池上标定相同一点作为每次实验小鼠的入水点。每个象限对应的侧壁上粘贴不同形状的标志。平台置于离入水点较远的象限中间,实验过程保持平台位置不变。(4)每次实验在隔音的房间内进行,水池,光源,鼠笼等实验室各物件的位置保持不变。(5)治疗结束后第3天开始训练,如果动物在120s内找到平台,让其在平台上停留20s,如果动物没有找到平台,将其放在平台上使其停留20s。(6)每次实验以120s为限,纪录每次各组动物能够到达平台的小鼠只数。若设定时间内未找到平台,计算机停止跟踪,记录时间为120s。(7)于治疗结束后4、5、6、7、8天继续学习和测试,记录每组小鼠找到平台的情况。4、结果A8治疗组学习记忆改善情况明显优于小鼠非特异性IgG注射组、生理盐水注射组、SAMP8空白对照组。各组找到平台小鼠的数目情况,测试第1天至第5天分别为:A8治疗组(0、2、3、4、4只);非特异性IgG注射组(1、1、0、0、0)、生理盐水注射组、SAMP8空白对照组(0、0、1、1、0)见图5(横坐标为治疗后的天数,纵坐标为各组找到平台小鼠的数目)。5、结论单抗A8有改善快速老化痴呆模型小鼠学习记忆能力的作用。实施例6单抗A8可变区基因的克隆取处于对数生长期的A8杂交瘤细胞(5×10⁶),采用Trizol试剂法提取杂交瘤细胞株A8的总RNA,取少量进行紫外分光光度计定量及1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳。利用5’RACE的方法扩增抗Aβ寡聚体单抗A8轻、重链可变区基因。分别跟据小鼠IgG轻链和重链恒定区CH-1区基因序列设计基因特异性引物L-GSP1:ACTGGATGGTGGGAAGATGG和H-GSP1:CAGTGGATAGACCGATGGGGG。根据试剂盒说明书以总RNA为模板,分别以L-GSP1和H-GSP1为引物,使用SuperScripII反转录酶合成cDNA第一链。反转录反应方案为:总RNA5μg,GSPxa0100nxa0mol/L,补加无Rnase水至18μL,70°C孵育10min后立即置冰浴上;继续向反应液中加入10×bufferxa02.5μL,25mmol/Lxa0MgCl₂xa02.5μL,10mxa0mol/Lxa0dNTPxa01μL,42°C孵育1min后加入1μLxa0200U/μLxa0SuperScripxa0II反转录酶,42°C反应50min,70°C孵育10min。反转录完毕后加入RNase水解RNA,使产物中只含有cDNA第一链。使用S.N.A.P离心柱纯化cDNA第一链,然后通过末端脱氧核苷酸转移酶TdT以dCTP为底物向cDNA第一链5’端加上Poly(C)尾巴。分别用以AAP:GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG与L-GSP2:GGGGAAxa0GATGGATACAGTTGGTGCAGC和AAP与H-GSP2GATAGCCGATGGGGGTGTTGTTTxa0TGG两对引物以已经加上Poly(C)尾巴的cDNA第一链为模板扩增抗体轻链和重链(VL、VH)可变区基因。扩增产物VH(约450bp)和VL(约429bp)经琼脂糖凝胶(1.5%)电泳鉴定,见图6。用PCR产物纯化试剂盒(Omega)回收纯化后,将目的片段克隆至T载体,测序分析(见序列表1-4)。PCR扩增反应按照常规方法进行:以上述产物为模板,分别用重链和轻链引物扩增抗体轻、重链可变区基因。反应体系为:cDNA5μL,上下游引物(10mmol/L)各1μL,10mmol/Lxa0dNTPxa02μL,10×bufferxa05μL,补加双蒸水至50μL,Exxa0Taqxa0DNA聚合酶1.25μl,加水至50μl,混匀,瞬时离心后,置PCR仪内反应。PCR条件为:95预变性5min,循环参数为94变性40s,55退火40s,72延伸1min,共30个循环,最后72延伸51min。目的片段T载体克隆测序方案如下:将PCR产物以试剂盒(Omega)纯化回收后,连入pMD18-T载体。连接反应体系为:pMD18-T载体1μl,PCR产物纯化重链(或轻链)4μl,连接缓冲液5μl,混匀后置4°C过夜,转化大肠杆菌DH5α,筛选重组克隆并测序。抗Aβ寡聚体单抗A8轻、重链可变区基因在制备用于诊断、预防和治疗AD的试剂(盒)及药物中的应用:抗Aβ寡聚体单抗A8轻、重链可变区基因应用方面的研究主要有:(1)建立可用于分析Aβ寡聚体的夹心ELISA法;(2)AD的预防及早期治疗研究:用于低龄SAMP8或Tg2576转基因鼠等AD动物模型,静脉、腹腔或颅内注射抗Aβ寡聚体单抗A8轻、重链可变区基因相关的多肽或抗体,通过观察学习记忆行为学、组织病理学以及分子细胞生物学改变,得到实验室数据;(3)AD的治疗研究:用于高龄或老年SAMP8或Tg2576转基因鼠等AD动物模型,静脉、腹腔或颅内注射抗Aβ寡聚体单抗A8轻、重链可变区基因相关的多肽或抗体,通过观察学习记忆行为学、组织病理学以及分子细胞生物学改变,得到实验室数据;(4);Aβ寡聚体单抗A8轻、重链可变区基因相关的多肽或抗体用于各期临床试验研究;(5)Aβ寡聚体单抗A8轻、重链可变区基因相关的多肽或抗体应用的副作用及并发症研究。(脑膜脑炎、出血)。以本发明所述的轻、重链可变区基因重构成一定形式的蛋白药物,可以直接用于AD的诊断及免疫治疗。以本发明所述及的轻、重链可变区基因编码的多肽,可重组成的新型抗体主要有下列几种形式:(1)嵌合抗体:是用鼠MAb的V区与人IgG的C区连接而成为人-鼠嵌合抗体。由于其完整地保存了鼠MAb的特异性和亲和力,同时降低了HAMA等不良反应,故在免疫治疗中显示出良好的效果。(2)人源化抗体:针对可变区基因结构的人源化改造,包括CDR移植、表面氨基酸残基修饰、骨架区交换、定位保留和表位导向选择等,从而不但降低了可变区的鼠源性同时又保持了鼠MAb的特异性和亲和力。(3)小分子抗体:主要有由VH-CH1和VL-CH1组成的Fab抗体、用一条多肽(Gly4Ser)3接头连接VH基因和VL基因而成的单链抗体、由VH和VL以非共价键结合而成Fv片段抗体、由VH或VL一个功能结构域组成的单域抗体、由单个CDR构成的最小识别单位等。(4)多价微型抗体:主要有双链抗体(ScFv)₂、Flex微型抗体、LD微型抗体、F(ab’)₂、F(ab’)₃、(ScFv)₄等。由于有多价抗原结合位点,亲和力高,分子大小适中,在肾脏中的清除率较慢的特点而具有较高的临床应用价值。(5)双特异性抗体:是一类具有双重特异性和双重功能的抗体,又称双功能抗体。(6)重组抗体融合蛋白:把Fab或Fv等基因片段,与非抗体的核酸或酶等其它生物功能分子连接形成的具有靶特定的生物活性重组蛋白。(7)噬菌体抗体:把Ig的V区基因与丝状噬菌体DNA上基因III或基因VIII连接经转染宿主菌后,使其在膜表面外壳蛋白表达Fab或ScFv的融合蛋白产物。通过对此产物多轮相关抗原的亲和吸附,从中筛选出所需的特异性抗体。以本发明所述及的轻、重链可变区基因编码的多肽,以及重构成一定形式的抗体,进行各种酶、生物素、荧光(Cy3、Cy5等)等标记。在上述研究的基础上,利用合成或原核表达的Aβ及寡聚化的Aβ作为标准抗原样品,建立夹心ELISA法分析最适的包被抗体及浓度,最适的生物素化的检测抗体(Aβ寡聚体特异性单克隆抗体)及浓度,同时以辣根过氧化物酶标记的亲和素和TMB为检测系统,获得可溶性Aβ寡聚体夹心ELISA分析方法,建立AD早期诊断方法的实验室标准。以上述由轻、重链可变区基因编码的多肽重组或衍生的抗体分子组装的AD以及AD相关疾病诊断试剂盒。